為確保產(chǎn)品的性能和無憂的操作，使用前請仔細(xì)閱讀本手冊，有任何疑問請咨詢本公司售后技術(shù)支持或當(dāng)?shù)氐匿N售人員（聯(lián)系方式見附錄）。
1.產(chǎn)品介紹
Focore 700是高剛性瓊脂糖內(nèi)部核球上鍵合辛胺功能基團(tuán)，高剛性瓊脂糖核球外部為惰性殼層，排阻極限為700KDa。在較高電導(dǎo)條件下，大于700KDa的目標(biāo)物通過微球之間的空隙流穿，屬于凝膠過濾的原理對目標(biāo)物進(jìn)行純化；小于700KDa的雜質(zhì)進(jìn)入微球內(nèi)部核球后，通過核球內(nèi)部的辛胺復(fù)合功能基團(tuán)進(jìn)行吸附結(jié)合，屬于離子交換和疏水多模式作用，可以去除目標(biāo)物中的宿主蛋白等雜質(zhì)，從而達(dá)到對目標(biāo)物流穿雜質(zhì)結(jié)合的分離純化目的。Focore 700主要用于病毒、病毒樣顆粒、病毒載體等流穿模式的分離純化。
特點：
a.快速、簡單（一步純化）。
b.與凝膠過濾相比，雜質(zhì)被吸附在內(nèi)部核球中，具有更高的上樣體積，有助于提高純化生產(chǎn)效率。
c.與復(fù)合型層析相比，外部惰性殼層對目標(biāo)物沒有吸附結(jié)合，回收率高，有助于保持生物分子的生物活性。
表1：性能參數(shù)
基質(zhì) | 高剛性瓊脂糖核球 |
粒徑范圍 | 45-165μm |
平均粒徑 | 90±5μm |
離子載量 | 40-85umol（Cl-）/ml（介質(zhì)） |
pH穩(wěn)定性 | 2-14（短期） 3-13（長期） |
化學(xué)穩(wěn)定性 | 所有常用緩沖液、1.0M氫氧化鈉、8M尿素、6M鹽酸胍、70%乙醇 避免使用氧化劑、陰離子去污劑、陰離子緩沖液 |
流速 | ≧300cm/h |
貯存溶液 | 20% 乙醇 |
貯存溫度 | 4-30℃ |
2.選擇指導(dǎo)
2.1 pH的選擇
a.當(dāng)雜質(zhì)所在溶液的pH?雜質(zhì)的等電點pI。
b.所使用溶液的pH應(yīng)該在樣品穩(wěn)定pH范圍以內(nèi)。
2.2 緩沖溶液的選擇
表2：推薦緩沖液
pH范圍 | 緩沖鹽 | 濃度（mM） |
4.0-5.0 | Acetate | 20-100 |
4.0-6.0 | Citrate | 20-200 |
5.5-6.5 | Bis-Tris | 20-50 |
6.0-7.5 | Phosphate | 20-200 |
7.5-8.5 | Tris | 20-50 |
8.5-10.5 | Glycin-NaOH | 20-100 |
說明：
a.選擇的緩沖液和鹽可能會干擾性能。
b.電導(dǎo)調(diào)節(jié)可以通過添加鹽或改變緩沖液的濃度。
c.在溶液配制后，用0.22μm過濾和脫氣處理（超聲或負(fù)壓）。
3 樣品的制備
樣品所在溶液要和平衡液保持一致。
樣品離心過濾。
4 純化流程
采用液滴對液滴（避免引入氣泡）的方式將柱子連接到層析系統(tǒng)上。
用平衡液以5ml/min的流速沖洗5CV（CV指柱床體積，下同）。
用洗脫液以5ml/min的流速沖洗5CV。
用平衡液以5ml/min的流速沖洗10CV。
將樣品以5ml/min的流速上樣。
用平衡液以5ml/min的流速沖洗10CV。
用洗脫液以5ml/min洗脫5CV或20CV(根據(jù)前期篩選實驗數(shù)據(jù)，采用階梯式洗脫5CV/線性梯度洗脫20CV)。
用再生液以5ml/min的流速沖洗5CV。
5 放大
5.1 保持柱床高度不變
5.2 保持線性流速不變
5.3 備注：若實際情況和實驗室數(shù)據(jù)有偏差，可以維持樣品保留時間不變。
6 維護(hù)
6.1平衡
柱子裝填完成后，用平衡液以60cm/h的流速沖洗5CV或沖洗至電導(dǎo)和pH值恒定。
6.2洗脫
每次分離純化后，用30%異丙醇，1M NaOH溶液以60cm/h的流速沖洗5CV或沖洗至電導(dǎo)和pH值恒定。
6.3在位清洗
在位清洗用于清洗再生沒有清洗干凈的物質(zhì)，例如脂類、沉淀物、變性蛋白。
a.強離子結(jié)合蛋白
用2.0M NaCl以60cm/h的流速反向沖洗5CV。
b.沉淀物、疏水結(jié)合蛋白、脂蛋白
用1.0M NaOH以30cm/h的流速反向沖洗5CV。
c.脂類、強疏水蛋白。
用1.0M NaOH，30%異丙醇以30cm/h的流速反向沖洗5CV
6.4消毒
用1.0M NaOH以30cm/h的流速反向沖洗5CV。
6.5滅菌
將介質(zhì)置換到0.5M NaCl ,pH 7.0的溶液中進(jìn)行高壓滅菌。
6.6保存
介質(zhì)在20%乙醇中4-30℃保存。
7.應(yīng)用案例
7.1預(yù)裝柱
Focore 700，1ml預(yù)裝柱；
7.2緩沖液
平衡液：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.38；
洗脫液：30%異丙醇，1M NaOH；
溶液配制完成經(jīng)0.45um水相濾膜過濾。
7.3狂犬病毒樣品預(yù)處理
樣品上樣前需經(jīng)過0.45um過濾。
7.4純化過程
純化過程中上樣流速為0.33ml/min。
平衡 | 平衡液30CV；1.0ml/min |
上樣 | 15.8ml，收流穿-L:23.31ml；0.33ml/min |
平衡液清洗 | 20CV；0.33ml/min |
洗脫100%B,10.2CV | 收洗脫峰E1:1.9ml（紅色）；0.5ml/min |
7.5純化圖譜
7.6總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線
BSA（ug/ml) | OD595 | Average | |
0 | 0.5559 | 0.5536 | 0.55475 |
125 | 0.6373 | 0.6456 | 0.64145 |
250 | 0.7294 | 0.7084 | 0.7189 |
500 | 0.8968 | 0.8959 | 0.89635 |
750 | 1.0044 | 1.0178 | 1.0111 |
1000 | 1.0865 | 1.1135 | 1.1 |
1500 | 1.4104 | 1.3992 | 1.4048 |
7.7蛋白去除率
OD595 | MEAN | C（mg/ml) | V(ML) | M(mg) | 蛋白去除率（%） | ||
原液（Y） | 0.5778 | 0.5826 | 0.5802 | 0.003333333 | 15.8 | 0.052666667 | / |
流穿（L） | 0.5862 | 0.5830 | 0.5846 | 0.010666667 | 23.31 | 0.24864 | 75.58 |
洗脫峰（E1） | 0.5822 | 0.5946 | 0.5884 | 0.017 | 1.9 | 0.0323 | 96.83 |
備注：蛋白去除率=[1-M各組分/M(L+E1+E2)]*100%.
7.8 ELISA抗原效價
a.消除空白后判定結(jié)果：將各孔測得A值減去空白孔A值；
b.將自備標(biāo)準(zhǔn)品和待測疫苗樣品稀釋度及對應(yīng)A值（消除空白后）分別取對數(shù)值；
c.以稀釋度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以A值對數(shù)為縱坐標(biāo)做散點圖；
d.得到自備標(biāo)準(zhǔn)品和待測疫苗樣品的散點圖及一次直線方程（通過添加趨勢線獲得），計算各趨勢線方程縱軸截距L；
e.計算疫苗樣品效力：若自備標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的國際單位為M（IU/ml），則待測疫苗樣品的效力為：（L樣品/L標(biāo)準(zhǔn)品）*M（IU/ml）
名稱 | OD450-1 | OD450-2 （空白校正后） | V(ML) | 病毒回收率 (%) |
空白 | 0.0629 | 0.0000 | / | / |
原液（Y） | / | / | 15.8 | / |
流穿液（L-128X） | 0.1371 | 0.0742 |
23.31
| 108.92 |
流穿液（L-64X） | 0.2298 | 0.1669 | 127.58 | |
流穿液（L-32X） | 0.3045 | 0.2416 | 123.46 | |
流穿液（L-16X） | 0.4478 | 0.3849 | 122.20 |
備注：病毒回收率=OD450(L)/OD450(Y)*100%
8.常見問題
表3：常見問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 解決方案 |
雜質(zhì)不與介質(zhì)結(jié)合或結(jié)合量較低 | 1.上樣量過載 | 降低上樣量 |
2.上樣速度過快 | 降低上樣流速 | |
3.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集 | 及時有效地清洗介質(zhì)或更換新的介質(zhì) | |
4.雜質(zhì)不帶電或與介質(zhì)帶同樣的電荷 | 篩選合適的結(jié)合緩沖液 | |
5.樣品中加入了不合適的去污劑 | 檢查樣品中是否有不合適的去污劑 | |
6.結(jié)合條件不佳 | 優(yōu)化結(jié)合條件（pH和電導(dǎo)） | |
目標(biāo)物純度較低
| 1.樣品沒有經(jīng)過前處理 | 樣品上柱前必須要經(jīng)過離心或過濾 |
2.樣品粘度過高 | 用平衡液適當(dāng)?shù)南♂寴悠罚档驼扯取?/span> | |
3.吸附模式下，洗雜不徹底 | 加大洗雜體積直至基線平穩(wěn)并與平衡液一致 | |
4.雜質(zhì)蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集沉淀 | 及時有效地清洗介質(zhì) | |
5.吸附模式下，洗脫條件不佳 | 優(yōu)化洗脫條件 | |
6.目標(biāo)物出現(xiàn)降解 | 檢測目標(biāo)物的穩(wěn)定性 | |
7.柱料裝填效果不佳 | 重新裝填或購買 | |
8.分離柱頂部有較大儲樣體積 | 重新裝柱或降低儲樣體積 | |
9.介質(zhì)中有微生物生長 | 介質(zhì)使用完后，請及時正確保存介質(zhì) | |
10.流穿模式下，雜質(zhì)結(jié)合條件不佳 | 優(yōu)化純化工藝條件 | |
介質(zhì)載量下降 | 1.上樣速度過快 | 降低上樣流速 |
2.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集，導(dǎo)致載量下降。 | 及時清洗介質(zhì) | |
3.使用次數(shù)過多，配基被氧化或脫落 | 及時清洗介質(zhì)或更換新介質(zhì) | |
色譜峰上升緩慢 | 介質(zhì)裝填過緊 | 重新裝柱 |
色譜峰上升緩慢或拖尾 | 介質(zhì)裝填太松 | 重新裝柱 |
柱床有裂縫或干涸 | 出現(xiàn)泄露或大體積氣泡引入 | 檢查管路是否有泄露或氣泡，重新裝柱 |
液流較慢 | 1.蛋白或脂類聚集 | 及時清洗介質(zhì)或濾膜 |
2.蛋白沉淀在介質(zhì)中 | 調(diào)整平衡液和洗脫液組分，以維持目標(biāo)物的穩(wěn)定性和介質(zhì)的結(jié)合效率 | |
3.分離柱中微生物生長 | 所用試劑必須經(jīng)過過濾和脫氣； 樣品上柱前必須離心或過濾 |
9.訂購信息
表4：訂購信息表
產(chǎn)品 | 規(guī)格 | 貨號 |
Focore 700 | 25ml | HF270311025M |
Focore 700 | 100ml | HF270311100M |
Focore 700 | 500ml | HF270311500M |
Focore 700 | 1L | HF270311001L |
Focore 700 | 5L | HF270311005L |
Focore 700 | 20L | HF270311020L |
備注：大規(guī)格包裝產(chǎn)品或其它產(chǎn)品購買，請咨詢本公司當(dāng)?shù)劁N售或售前技術(shù)支持。
地址：武漢市東湖開發(fā)區(qū)高新二路388號光谷國際生物醫(yī)藥企業(yè)加速器C11棟20層
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