序號

客戶問題

匯研答案

 1

 目的蛋白6OKD，雜蛋白大于120KD，如何選擇分子篩填料？

建議選擇200PG，用16/70的柱子。

 2

 用來分離纖維低聚糖單體你們哪款單體比較合適?。?/span>

這個屬于小分子分離純化了，硬膠更適合一些，聚丙烯酰胺凝膠柱。我們的產(chǎn)品推薦用陽離子交換填料試一下。

 3

 像我們1cm*20cm的柱子大概需要多少Sephadex  G-25填料呀？

3.14×0.5×0.5×20=15.7ml  我們的G25是干粉，溶脹系數(shù)4-6倍，按照這個比例，只需要3-5g就夠了   

 4

 分離多肽比較常用的是哪些產(chǎn)品呀？

我們這邊有客戶走到生產(chǎn)級別的，用的是SP和MMC。

 5

 目的蛋白和雜蛋白分子量都是50-500kd要怎么選啊？

如果雜蛋白和目的蛋白分子量相差不大，那么分子篩產(chǎn)品是無法分離的，可以選擇親和，離子交換或者疏水填料。

 6

 賽默飛有款Pierce Zeba快速脫鹽產(chǎn)品，你們的填料能這么用嗎？

我們的用不了。賽默飛這款相當于超濾離心管。通過離心對蛋白溶液進行置換，以達到脫鹽換液的目的。我們的如果這樣操作，填料會流干，蛋白濃度就會很大，蛋白析出或者變性都有可能。而且該操作可能把填料的孔都堵住，所以不能這么操作。

 7

 咨詢脫鹽柱G25填料？

建議推薦30pg,G25分子篩干粉，分離范圍是1k-5k,葡聚糖聚合是第一代分子篩，試用前要煮沸成濕膠狀態(tài)。而30pg是濕膠狀態(tài)，分離范圍是可以，葡聚糖和纖維素具有一定的剛性，屬于第二代分子篩?？梢試L試，

 8

 螯合好的鎳柱填料有哪些及其使用范圍？

鎳柱有三款填料，IDA、IMAC、TED，具體內(nèi)容請參看最新產(chǎn)品手冊第26-27頁，一般推薦是常規(guī)粒徑的.

 9

 請問硬膠和軟膠有什么區(qū)別？

硬膠主要是耐壓比較大，效率高一些，但純化過程對生物活性影響比較大，非特異性吸附，而軟膠反壓較小，可保持生物活性。

 10

 一般用離子填料耐高壓，有沒有合適的填料能夠替換GE的30Q??？

小分子核甘酸純化耐壓大概5bar等，推薦我們的Q-HPR能對標進口，這款填料平均粒徑是37μm,耐壓是5bar,可以嘗試。

 11

 之前購買預活化NHS偶聯(lián)效果不太好有沒有其他合適的填料推薦？

一般推薦客戶使用CNBr填料，主要CNBr和NHS偶聯(lián)的官能團是氨基，但前者偶聯(lián)量更大一些，效果也更好一些。

 12

 工藝開發(fā)的時候樣品在高鹽條件下選擇疏水填料，或者  陽離子填料嘗試，但效果不太好怎么辦？

可以嘗試多模式層析填料摸索合適的洗脫條件。

 13

 小鼠IgM用NHS這個填料偶聯(lián)蛋白的比例是多少呀？

分子量越大的偶聯(lián)量越低，建議1-3mg（IgM）/ml（NHS）

 14

 想找一款鎳柱填料，之前使用的粒徑是FF，容易堵塞孔載量不高？

我們公司可以根據(jù)樣品的實際情況做定制化填料，建議使用大顆粒填料如Ni-IDA-BB來避免出現(xiàn)堵塞。

 15

 分子篩分離效果不太好是什么原因？

1、目標蛋白和雜質(zhì)的分子量差異比較小2、裝柱高度在60cm，純化組分分離一般上樣量控制在5%以內(nèi)，組群分離控制在30%。

 16

 親和鎳純化原核胞外蛋白選擇高分辨率，重力柱可以裝這款填料嗎？

1、重力柱一般選擇Ni-IMAC-FF，平均粒徑90μm，ＨＰ的平均粒徑是37μm，小粒徑分辨率高，同時反壓也比較大，一般重力柱選擇90μm的。

 17

 客戶之前用了一下我們的Q柱和Ni柱，都出現(xiàn)了填料發(fā)紅的情況，可以洗掉嗎？

填料本身是沒有紅色的物質(zhì)，確認一下樣品中是否有紅色的雜質(zhì)吸附在微球上，如酚紅或色素等。如果是吸附的雜質(zhì)，可以嘗試用高鹽清洗一下。如果還不行，可以嘗試用8M尿素或者1M氫氧化鈉+30%異丙醇清洗。

 18

 DEAE-6FF填料使用過程中，由于樣品中有添加低濃度的錳離子，在堿處理過程中填料顏色變黑了怎么辦？

1.將填料用1M HCl浸泡處理24h，然后用純化水洗膠至接近中性，但檢測結果顯示離子載量合格，但蛋白載量僅為合格載量的50%；2.為預防填料變黑，可在2M NaCl處理過后，用純化水沖洗柱子10個柱體積以上，再用0.5M NaOH處理。

 19

我們的30PG和75PG產(chǎn)品一般都能做多少次？

沒有具體驗證過，分子篩和離子交換產(chǎn)品，理論上是可以使用300-500次，實際上是200次左右，親和填料，理論使用次數(shù)是150-200次，實際上100次左右。具體使用次數(shù)主要還是看樣品清潔度和使用者的習慣及填料保養(yǎng)及清洗狀態(tài)。

 20

 什么是嗜硫吸附？Plasmid對閉環(huán)DNA是嗜硫吸附嗎?為什么該填料對開環(huán)DNA不吸附？

很多個堿基組成DNA鏈，鏈與鏈之間通過二硫鍵結合。我們這個Plasmid填料就是作用在二硫鍵上的。開環(huán)DNA的二硫鍵被打開了，所以填料Plasmid不能吸附開環(huán)DNA。

 21

 怎樣去除樣品中的色素？

1.30PG脫鹽柱處理。2.Q柱，結合模式。3.SP柱，流穿模式。

 22

 直徑450的，柱高28cm 可以做G25脫鹽柱嗎？上樣量呢？

可以做脫鹽柱，不過建議不要裝太高，裝太高了流速會很慢，建議不超過20cm。上樣量研發(fā)階段30%，生產(chǎn)級別20-25%。

 23

 1.請問EAH的15個原子間隔臂是peg形式的還是烷基？ 2.請問NHS填料用普通異丙醇保存就可以了嗎？3.G75 和75PG這兩個性質(zhì)有什么差異嗎？

1.親水鏈。2.沒用過的可以。3.G75原材料是葡聚糖，75PG原材料是瓊脂糖+葡聚糖+纖維素

 24

 1.溴化氫填料時間長了，結合抗原能力下降？2.蛋白液中含有尿素，對填料的偶聯(lián)影響有多大？3.4FF的孔徑是多少？

1.6個月后載量會降低30%-40%。2.確保偶聯(lián)時的 pH 和鹽濃度與 B 液一致：0.2M NaHCO3、0.5 M NaCl，調(diào)節(jié) pH 8.3（如果要偶聯(lián)的生物分子為 IgG 時，pH=8.5-9.0），室溫保存。3.數(shù)字4和6代表含糖量，含糖量越低，孔徑越大，4FF，4BB，孔徑是80nm左右，6FF，6BB，孔徑是50nm左右。

 25

 抗菌肽純化，等電點是11.17，求推薦合適的純化方案？

等電點大于6，基本是選擇陽離子填料，陽離子填料上帶負電荷。層析填料分為四大類，凝膠過濾，離子交換，親和，疏水。
親和的不適合您的項目，成本太高。
凝膠過濾，一般是實在沒有別的層析純化方案，才會選擇這一種，優(yōu)勢是純度和收率比較高，劣勢也很明顯，上樣量只有5%，而且裝柱高度有明確的要求，放大生產(chǎn)的時候，需要選擇更高配置的層析設備。
就只剩下離子交換和疏水層析了。

 26

 Ni柱是每次用完后都要清洗再生嗎？（上樣后，淋洗的時候，5ml/min的流速，柱壓在0.22）

最好是每次洗脫結束后都重新再生一次，如果樣品比較干凈，3-5次后，再掛鎳重生也可以。如果不再生，洗脫后用純水洗，然后再過平衡液，再用20%乙醇保存。如果到了生產(chǎn)級別，建議每使用一次，都清洗，可以增加填料的壽命。

 27

 Tris、EDTA和硫酸銨對Q Focurose HPR有影響嗎？過柱洗脫的樣品凝固了怎么辦，樣品中有硫酸銨，洗脫液有1M氯化鈉。

Tris和EDTA影響不用考慮，硫酸銨需要考慮濃度和pH對上樣或洗脫的影響。建議降低洗脫液的氯化鈉濃度為0.5M，洗脫液下來后馬上用不含氯化鈉的洗脫液稀釋（保證pH與洗脫液一致）。另外，柱子要裝成矮胖子而不是細長個，防止因為洗脫過程中局部濃度過大導致蛋白析出。

 28

 MMC掛上不下來，用2M，KCl都洗不下來，有沒有別的洗脫方法推薦的，還有MMC上面是什么疏水配基？

MMC上是苯基疏水基團，洗脫液鹽濃度范圍是0.5M-2M，建議前期緩沖體系或者上樣體系調(diào)整，讓目的蛋白不要跟填料結合太緊。

 29

 客戶反映DEAE FF填料使用后經(jīng)堿處理顏色變黑是什么原因，該怎么處理？

DEAE FF是可以耐酸耐堿的，工作狀態(tài)下可以耐受pH 2-9，保存的話，短期保存可以耐受pH 2-14，長期保存可以耐受pH 2-12。
經(jīng)過與客戶溝通確認，懷疑是樣品中添加的硫酸錳殘留，遇到高濃度氫氧根離子所致。
有如下建議方案：
先嘗試用pH2-3的HCl或醋酸 以30cm/h的流速處理5CV，觀察看顏色是否有變化。

針對該種情況，處理方法可以按以下步驟來：
1、樣品洗脫結束后，用純化水以60cm/h的流速處理5-10CV，清洗掉殘留的樣品和再生液（平衡液+1M NaCl）；
2、用2M NaCl 以60cm/h的流速處理5CV，除去強離子結合的蛋白；
3、繼續(xù)用純化水 以60cm/h的流速處理10CV以上；
4、用0.2-0.5M NaOH 以30cm/h的流速處理5CV，除去一些疏水結合蛋白、沉淀物、脂蛋白等；
5、用純化水 以30cm/h的流速處理至接近中性；
6、最后用20%乙醇 以30cm/h的流速保存
以上過程如果方便，建議反向沖洗。

 30

 重力柱如何使用？

重力柱跟正常的層析相比，原理完全一樣，只是沒有檢測器的配合，所有的收集樣品全憑經(jīng)驗。原則上，凝膠過濾三分之一柱體積收集樣品，收集2-3倍上樣量。其余掛柱的，換洗脫液后1個柱體積開始收集，收2-3個柱體積。

  31

 離子交換條件怎樣設定？

陽離子：pH值低于等電點0.5左右，掛柱模式；pH值高于等電點0.5左右，流穿模式。陰離子：pH值高于等電點0.5左右，掛柱模式；pH值低于等電點0.5左右，流穿模式。                            

  32

 蛋白純化過程中離子填料如何選擇？

根據(jù)蛋白的等電點，如果蛋白等電點在8左右，采取陽離子掛柱陰離子流穿模式。如果蛋白等電點在6左右，就反過來，采用陰離子掛柱陽離子流穿。掛柱的可以考慮用復合填料MMC或MMA代替。一般都需要用兩根柱子，一陰一陽，一個掛柱模式一個流穿模式。

 33

 預活化介質(zhì)偶聯(lián)配基時，偶聯(lián)時間如何確定？

偶聯(lián)時間要根據(jù)實際反應情況跟蹤控制。一般以上清液中，待偶聯(lián)物質(zhì)濃度不再減小作為偶聯(lián)完成的根據(jù)。拿蛋白來說，即為上清液UV280值不再有明顯的降低，即可認為偶聯(lián)過程已經(jīng)完成。

 34

 Ni-IDA或者是Ni-IMAC，使用過程中發(fā)現(xiàn)填料變成棕褐色是什么原因？

是因為填料上的Ni脫落，并在堿性環(huán)境中發(fā)生化學反應生成氫氧化鎳沉淀所致。一般可以用0.1M的EDTA緩慢沖洗兩小時以求復原。

 35

    填料該如何保存？

親和填料，一般2-8度保存，其余填料，室溫陰暗保存。不能凍結。一旦結冰凍結，復融時填料基質(zhì)有可能會破碎。

序號

客戶問題

匯研答案

 1

 之前用你們匯研的proteinA和G兩種試用裝對人的血液抗體A進行純化，用平衡液一沖就全出來了，后面再用洗脫液洗脫的時候不出峰了，上樣1ml，緩沖液PB的PH7.4，流速0.5ml/min,儲存溶液用的PH7.2的PB，鹽濃度用的0.02M，是什么原因?qū)е碌模?/span>

 出現(xiàn)這種情況可能有這幾個原因：1.1ml的樣品中對應的抗體濃度大約6.9至7mg/ml的話，人血清中純化抗體濃度和量較低，洗脫液中抗體濃度低于檢測下限，建議人血清樣品增加上樣倍數(shù)至40倍以上（稀釋后的上樣體積，人血清體積3-5倍） 2.確認一下樣品上樣前的條件，主要是PH和電導，建議用平衡液稀釋10倍以上，復測PH和電導的差異（平衡液稀釋后PH和電導差異較小，不用調(diào)整）

 2

 我們的樣本含有40mM咪唑可以上離子交換柱嗎？用的你們匯研的SP，樣本含有40mM咪唑，1mMPMSF,1mM-EM，2mMDTT，這個帶10個his標簽的蛋白超聲時得有500mM鹽，一定要先透析掉鹽再上柱嗎？

1 、高鹽對于超聲破碎的影響比較小，主要是看蛋白的穩(wěn)定性。所以關注點不是高鹽超聲破碎，而是上柱的填料對送溶液電導的要求，例如，過SP預裝柱，可以低鹽超聲破碎也可以高鹽超聲破碎，但是上樣前需要檢測電導，如果高于10mS/cm，需要對樣品緩沖液置換透析或直接加上柱平衡液進行稀釋電導至10mS/cm以下。

2、超聲后用上清還是沉淀復溶上樣，取決于目標物是在上清還是沉淀，初次實驗或不確定時，建議上清和下層沉淀分別取樣電泳，確定目標物在上清還是沉淀中。
目標物在上清表達是可溶的，在下層沉淀是表達包涵體，需要用尿素或鹽酸胍溶解后上樣，純化后復性。

 3

 我們是做DNA聚合酶的表達純化，目前是用鎳柱進行純化，純化后純度很純，基本只有一條目的蛋白，然后過肝素柱子的目的是想把基因組DNA去除，但是過完肝素柱子除了目的蛋白，還出現(xiàn)了疑似目的蛋白的二聚體，而且只用肝素柱子一步純化，純度差，還有一個問題是用肝素柱子的時候好多蛋白不掛柱，你們匯研有這方面的例子嗎？我們的目標蛋白是DNA聚合酶，理論上是結合肝素的，這方面優(yōu)化平衡液和樣品填料能實現(xiàn)最終純化嗎？

  肝素是親和填料，只對特定目標物結合，不是所有蛋白都結合，如果目標物不結合或結合量很少，需要優(yōu)化平衡液和樣品的條件，讓樣品和填料充分結合。可以的，但是看客戶的純度要求，純度要求非常高的話還是建議兩步或兩步以上純化。

 4

 我們用的桿狀病毒表達系統(tǒng)，之前掛柱效果不理想，這次將His標簽長度增加到10個了，這種情況推薦哪一款鎳柱呀？之前用過GE的填料，普通的那種，也用過你們匯研的耐EDTA的那種預裝柱TED。

 TED的載量最低，但是耐EDTA。如果可以用普通的Ni柱，不需要耐EDTA的話，可以用IMAC試試。

 5

 在細胞里擴增病毒，如何能更好的和細胞成分分離開？離心的時候有很多病毒被帶到沉淀里

  如果有遇到很多病毒被帶到沉淀里，且病毒濃度不大的話，那么可能是在由感染細胞或組織勻漿中提取病毒時，由于與病毒大小相近的細胞亞單位及碎片的存在，導致提純效果不理想。
有看到類似情況的，可以嘗試差速離心法。
原理是：不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差別，沉降速度差別（相差）在一個或幾個數(shù)量級的粒子，可用差速離心法分離提取待純化的病毒。

  簡單說，是將被分離的樣品交替進行低速離心與高速（或超速）離心。差速離心適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附－釋放的病毒懸液中提純病毒。
具體做法是：以差速離心法分離提純病毒時，經(jīng)常以低速 (2000~3000r/min，20~30min) 及中速(10000 r/min，20~30min) 去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60min內(nèi)能夠沉淀80%以上的病毒粒子的較高速度，離心 1~2h使病毒沉淀。

 6

 DNA聚合酶純化后，要檢測這個基因組DNA殘留，該怎么檢測？

定性的話就用DNA電泳試試，定量就麻煩些，用同位素法或者做熒光定量pcr。

 7

 G50和G75 這幾款葡聚糖配合重力柱試用，需要額外加壓嗎？

  重力柱不能加壓，用重力柱做G75一類的這些東西的拖延或者緩沖液置換，就是算體積的，核心的思想就是你的樣品的進去測，你看好柱體積，1/3個柱體積開始收集，就是1/3柱體積開始出峰，理論就是這樣子。如果你的柱子是四毫升，那就是3.3毫升，你下面看到過了3.3毫升之后開始收，大概收個幾毫升吧，可以首兩個至一個體積左右，你上樣量大概翻個三倍左右，你上一毫升就收三毫升以上，兩毫升就收六毫升，差不多就是這樣一個范圍，重力柱的話完全就是憑經(jīng)驗做的，沒有任何檢測就是在線檢測的。

 8

 1，將高親和力的單抗偶聯(lián)到填料中，純化樣品中的特異性蛋白，請問你們匯研目前有沒有做過中試規(guī)模的例子可供分享？2.人源化抗體好偶聯(lián)嗎？3.這種偶聯(lián)填料都裝多大的柱子，如果處理樣品量比較大，你們能不能做?

 我們有做過納米抗體偶聯(lián)的項目，做過幾十升中試規(guī)模的。您那邊方便的可以把抗體寄過來，我們幫您偶聯(lián)，可能前期要做一個基質(zhì)微球的篩選。

 9

 豬腹瀉全病毒純化：1.滅活前還是滅活后純化？2.收率多少，檢測方法是什么？3.色素問題？

1.兩種方式都有，要根據(jù)具體的工藝具體安排。2.兩種純化方案收率不同，要根據(jù)自己的產(chǎn)品情況選擇。檢測方法是客戶提供的，不方便透露。3.色素是后洗脫出來的。

 10

 病毒被帶到沉淀里怎能辦？

 如果有遇到很多病毒被帶到沉淀里，且病毒濃度不大的話，那么可能是在由感染細胞或組織勻漿中提取病毒時，由于與病毒大小相近的細胞亞單位及碎片的存在，導致提純效果不理想。
有看到類似情況的，可以嘗試差速離心法。具體做法是：以差速離心法分離提純病毒時，經(jīng)常以低速 (2000~3000r/min，20~30min) 及中速(10000 r/min，20~30min) 去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60min內(nèi)能夠沉淀80%以上的病毒粒子的較高速度，離心 1~2h使病毒沉淀。

 11

 怎樣鑒定樣品中的二聚體？

 用我們的分子篩填料，分辨率不夠很難鑒定出來。建議用HPLC，根據(jù)分子量范圍選擇一根合適的分子篩柱子，在目標蛋白峰前面出的小峰即為二聚體。