案例分享 | 人血清白蛋白純化工藝分享

關(guān)于人血清白蛋白

1.1 人血清白蛋白介紹

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）是血液中含量最豐富且化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，是由585個氨基酸組成的單鏈非糖基化多肽，分子質(zhì)量為66.5KD，等電點在4.7~4.9之間。成熟的HSA是一個心形分子結(jié)構(gòu)，如圖1所示，由3個結(jié)構(gòu)相似的α-螺旋結(jié)構(gòu)域組成（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），每個結(jié)構(gòu)域包含2個亞結(jié)構(gòu)域（A和B），其中結(jié)構(gòu)域ⅡA和ⅢA能夠與內(nèi)源和外源物質(zhì)相結(jié)合。氨基酸全序列含有18種氨基酸，N末端為天冬氨酸，C末端為亮氨酸。其中含半胱氨酸35個，在單鏈分子內(nèi)形成17對交叉相連的二硫鍵從而加固了分子的穩(wěn)定性，提高了對酸和熱的耐受性較高，同時分子內(nèi)大量極性氨基酸也使HSA有較高的溶解度。HSA純品呈淺黃色粉末，水溶液為黃褐色或暗綠色的澄明液體。

圖1. HSA的結(jié)構(gòu)

1.2 人血清白蛋白在機體中的生理作用

1.3 人血清白蛋白現(xiàn)狀

我國人血清白蛋白市場一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，受制于原料血漿供應(yīng)、國外大型企業(yè)席卷的影響，國內(nèi)血液制品企業(yè)競爭異常激烈。中國是人口大國，對人血清白蛋白的需求旺盛。目前臨床上應(yīng)用的人血清蛋白主要來自于血液提取，然而人類血液中可能存在慢性乙肝、艾滋病等傳染性疾病因子，且即使經(jīng)過純化工藝也難以保證病毒不會帶入產(chǎn)品中；另一方面血液供應(yīng)也有限，特別是近年來生物醫(yī)藥快速發(fā)展，人血清白蛋白作為工業(yè)原輔料的需求量越來越大，使本來臨床短缺的白蛋白更是雪上加霜，因此，尋找血液替代品迫在眉睫。

1.4 重組人血清白蛋白

重組人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin，簡稱rHSA）是一種通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的人血清白蛋白。這種白蛋白的生產(chǎn)不依賴于人類的血漿，而是通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中表達(dá)人血清白蛋白基因來實現(xiàn)。

與傳統(tǒng)的從血漿中提取的人血清白蛋白相比，重組人血清白蛋白具有許多優(yōu)勢。首先，由于其不依賴于人類血漿，因此消除了與血漿相關(guān)的疾病傳播風(fēng)險。其次，重組人血清白蛋白的生產(chǎn)不受血漿供應(yīng)的限制，因此可以大規(guī)模生產(chǎn)，滿足市場對血清白蛋白的需求。

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重組人血清白蛋白純化應(yīng)用案例

2.1 純化背景

為了解決血清白蛋白的缺口，越來越多國家通過遺傳工程方法制備rHSA。相比較于pHSA，rHSA純化方法需要更加的精細(xì)和復(fù)雜。一方面，由細(xì)菌或真菌發(fā)酵生產(chǎn)的rHSA，發(fā)酵液中會包含微生物組分和其分泌物，如蛋白酶、核酸、色素、內(nèi)毒素、多糖和熱源物質(zhì)等。發(fā)酵液中的蛋白酶需及時除去以免降解rHSA；細(xì)胞組分輸入人體引起過敏或毒性反應(yīng)將會嚴(yán)重威脅人的安全。因為rHSA常用劑量比較大，即使是99.999%的純度，每次至少輸入10g的rHSA，也會引入0.1mg的雜質(zhì)，對于人體安全是極大的威脅。由此可見，對于rHSA的純化技術(shù)要求極高，同時純化的成本也應(yīng)盡可能低，才能占據(jù)一定的市場競爭力。白蛋白中的雜質(zhì)主要包括白蛋白二聚體和本身的降解物，宿主本身雜質(zhì)如宿主蛋白，脂肪酸和DNA，還有發(fā)酵液中存在的色素，內(nèi)毒素，多糖，蛋白酶，熱源物質(zhì)等。

2.2 純化工藝

   2.2.1陰離子交換層析結(jié)合模式（Q Focurose HPR）

平衡液：Buffer A（20mM PB，pH6.0）

洗脫液：Buffer B（20mM PB，1M NaCl，pH6.0）

再生液：Buffer C（0.5M NaOH）

洗脫方式：10% Buffer B

層析圖譜：

   2.2.2 疏水層析流穿模式（Phenyl Focurose HP）

平衡液：Buffer A（20mM PB，硫酸銨，pH6.0）（70mS/cm）【BufferA為20mM PB，1.5M硫酸銨，pH6.0與Buffer B混合而成】

洗脫液：Buffer B（20mM PB，pH6.0）

再生液：Buffer C（純化水）

消毒：Buffer D （0.5M NaOH）

層析圖譜：

2.3 電泳膠圖

2.4 HPLC檢測

   2.4.1 疏水流穿HPLC檢測圖譜

   2.4.2 疏水背景HPLC檢測圖譜

2.5 結(jié)果與討論

本實驗采用Q Focurose HPR的結(jié)合模式+ Phenyl Focurose HP的疏水流穿模式，從膠圖中可以看出，經(jīng)兩步層析后，純度較高，無其他雜蛋白。由HPLC結(jié)果分析， 去除溶劑峰，經(jīng)兩步層析后，白蛋白純度在99.9 %以上。

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