案例分享 | 膠原蛋白純化工藝分享

膠原蛋白純化

案例介紹

膠原蛋白是由動(dòng)物的成纖細(xì)胞合成的一種生物高分子，是一種白色、不透明、無支鏈的纖維型蛋白質(zhì)，富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸。

膠原蛋白具備高拉伸強(qiáng)度、生物降解性能、低細(xì)胞毒性等特性，并且作為創(chuàng)傷敷料時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞粘附，是一種適用范圍廣泛的生物醫(yī)用材料，目前已應(yīng)用在敷料、人工器官再生醫(yī)學(xué)、組織工程、生物護(hù)膚等領(lǐng)域。

膠原蛋白的介紹

膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征

膠原蛋白最普遍的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，由三條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，三條相互獨(dú)立的膠原蛋白肽鏈依靠甘氨酸之間形成的氫鍵維系纏繞的結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。

膠原蛋白的分類

膠原蛋白可分為動(dòng)物膠原蛋白和重組膠原蛋白。動(dòng)物膠原蛋白是利用膠原純化技術(shù)獲得具有天然膠原完整蛋白片段和三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，在結(jié)構(gòu)上保證膠原蛋白的生物學(xué)活性。動(dòng)物膠原蛋白以牛、魚等動(dòng)物提取制備，純化工藝難度較高。重組膠原蛋白，是基于基因重組技術(shù)，將人體中天然膠原蛋白的全長(zhǎng)或部分基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移至基因工程改造的真核或原核細(xì)胞中，再通過發(fā)酵培養(yǎng)等手段表達(dá)純化得到膠原蛋白。

膠原蛋白主流提取制備方法

目前市場(chǎng)上主流的膠原蛋白提取制備方法有兩種：基因重組法和動(dòng)物源提取法。動(dòng)物源提取法是指通過酸法、堿法、酶法等方式從動(dòng)物肌腱、皮膚等組織中來提取膠原蛋白，過程可大致分為處理、溶出和純化3個(gè)步驟。基因重組法是將人體膠原蛋白基因進(jìn)行特定序列設(shè)計(jì)、酶切和拼接、連接載體后轉(zhuǎn)入工程細(xì)胞，通過發(fā)酵表達(dá)生產(chǎn)膠原蛋白?；蛑亟M法制備重組膠原蛋白主要包括表達(dá)體系的構(gòu)建、發(fā)酵以及純化3個(gè)過程。

膠原蛋白純化應(yīng)用案例

經(jīng)過蛋白酶酶解過后，會(huì)得到多肽、多種氨基酸、小分子蛋白等復(fù)雜的混合物，需要通過分離純化技術(shù)得到高純度制品。在分離純化之前，首先需要了解分離純化的目的，產(chǎn)品純度和總回收率。另外，還需要了解目的蛋白的分子量、等電點(diǎn)、溶解性及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，提取過程中需要保證蛋白質(zhì)組成成分、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物活性不發(fā)生改變。

線性洗脫

填料：Pheny Focurose HP

Buffer A: 20mM PB, 1.5M 硫酸鈉, 2mM EDTA, pH 7.0

上樣：樣品澄清過濾

Buffer B: 20mM PB, 100mM 硫酸鈉, 2mM EDTA, pH 7.0

洗脫方式：Buffer A 與0-100%Buffer B線性洗脫

樣品上樣后，目標(biāo)蛋白和一部分雜蛋白可以與填料結(jié)合，不能與填料結(jié)合的雜質(zhì)則會(huì)流穿出去，形成層析圖上的流穿峰，在該部分就可以起到一部分除雜效果；結(jié)合蛋白吸附在填料上等待后續(xù)洗脫。實(shí)驗(yàn)初期不確定目標(biāo)條帶會(huì)出現(xiàn)在何處，首先采用線性洗脫的方法，并結(jié)合電泳檢測(cè)確認(rèn)雜質(zhì)與目標(biāo)條帶所處位置，從而進(jìn)行精細(xì)純化。

由層析圖可見，線性洗脫過程中出現(xiàn)多個(gè)峰，分別對(duì)各峰進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)合目標(biāo)蛋白分子量大小以及電泳Marker條帶位置則可確定目標(biāo)蛋白。

根據(jù)電泳結(jié)果顯示，E中存在目標(biāo)蛋白，但目標(biāo)蛋白中還存在雜質(zhì)，需要進(jìn)一步純化。后續(xù)可采取分步梯度的方法，將雜質(zhì)與目標(biāo)蛋白在不同的梯度中分開，并繼續(xù)用電泳檢測(cè)條帶純度。

梯度洗脫

填料：Pheny Focurose HP

Buffer A: 20mM PB, 1.5M 硫酸鈉, pH 7.0

上樣：樣品澄清過濾

Buffer B: 20mM PB, 100mM 硫酸鈉, pH 7.0

洗脫方式：Buffer A 分別與30%、70%、100%Buffer B分步梯度洗脫

在線性洗脫結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，確定洗脫梯度分別為30、70%、100%。由層析圖可見，經(jīng)分步梯度洗脫后，可將線性洗脫中有重疊部分的峰完全分開。

經(jīng)電泳檢測(cè)可見30%洗脫可將結(jié)合的不太牢的雜質(zhì)先一步去除，70%洗脫中純化出純度高的目標(biāo)條帶，100%洗脫可將其余結(jié)合較牢固的雜質(zhì)全部去除。

由以上應(yīng)用案例可見，經(jīng)提取出來的蛋白存在很多雜質(zhì)，純度很低，采用層析柱可對(duì)其進(jìn)行純化。首先采用線性洗脫進(jìn)行初步純化，結(jié)合電泳確定目標(biāo)蛋白所在位置，此時(shí)目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)未能徹底分開。在此結(jié)果上繼續(xù)優(yōu)化，采用梯度洗脫的方法將雜質(zhì)與目標(biāo)蛋白徹底分開，得到高純度的蛋白。

- END -

關(guān)于我們

武漢匯研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子層析介質(zhì)研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有大批高科技人才，在研發(fā)和創(chuàng)新能力方面投入了大量資金，擁有多項(xiàng)專利技術(shù)。通過獨(dú)特的凝膠微球表面改性技術(shù)，我們能夠生產(chǎn)凝膠、親和、離子、疏水、多模式等五大類100多種生物大分子層析介質(zhì)產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于疫苗、抗體、重組蛋白、基因治療等領(lǐng)域。在層析介質(zhì)的基礎(chǔ)上，我們同時(shí)還提供特色的定制化填料開發(fā)服務(wù)和生物大分子純化工藝開發(fā)服務(wù)。      匯研生物目前已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了單條3000升瓊脂糖（多糖）微球生產(chǎn)線