干貨分享 | 微球基質(zhì)分子量的測定原理

  微球基質(zhì)是層析填料的基礎，良好的微球應具有如下性質(zhì)：

1. 合適的粒徑大小和形態(tài)，良好的粒徑分布；

2. 較高的機械強度；

3. 良好的穩(wěn)定性；

4. 擁有能和其他試劑發(fā)生化學反應的功能基團；

5. 較低的非特異性吸附；

6. 成本低，可再生。

分離介質(zhì)的種類很多，按照骨架基質(zhì)分類，有多糖類（如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖）、有機介質(zhì)（如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺）和無機介質(zhì)（如硅膠、玻璃珠、氧化物）。

我們生產(chǎn)的凝膠、親和、離子、疏水、多模式等五大類100多種生物大分子層析介質(zhì)，其微球就是多糖類基質(zhì)。多糖類是最早被用作生化分離的材料，它們孔隙率較高，都擁有良好的親水性和生物相容性，容易衍生化，在廣泛的pH范圍內(nèi)使用穩(wěn)定，容易再生，表面積大。

多糖類是高分子化合物， 高分子化合物之所以具有許多獨特的性質(zhì)，最重要的原因是分子量大。對于高分子的強度等物性，存在著一個臨界分子量 M0，超過這個分子量時開始出現(xiàn)強度。當分子量超過 M0 時強度達到一定值。所以分子量的控制對于微球來說比較關鍵。

圖1 分子量與強度的關系

高聚物除了分子量大，還具有多分散性， 即同一種聚合物，其分子量的大小各不相同。一般用平均分子量表征高聚物的分子量大小。根據(jù)統(tǒng)計方法不同，可分為：數(shù)均分子量Mn、重均分子量Mw、Z均分子量和粘均分子量。

分子量高的鏈條更加容易聚集成膠束，沒有發(fā)生聚集的低分子鏈條則會留在網(wǎng)絡中，再次加熱時很容易離開網(wǎng)絡。因此多糖類分子量會影響微球的孔隙率和孔徑。了解多糖類的各種分子量及分子量分布，是了解多糖類性質(zhì)的第一步，控制分子量也是合成微球的一個重要參數(shù)。

01

數(shù)均分子量Mn

其物理意義是各個不同分子量的分子所占的數(shù)量分數(shù)與其相對應的分子量乘積的總和。計算公式如下：

式中，Mi：單鏈分子量

         ni：具有相應分子量的鏈數(shù)目

         Xi：某一種分子量的分子數(shù)占總分子數(shù)的比例

簡單來說，就是先取其中一種分子的分子量與乘以這種分子在總分子數(shù)中的占比，然后將所有分子量的分子都這么處理之后求和得到。

02

重均分子量Mw

其物理意義是各個不同分子量的分子所占的重量分數(shù)與其相對應的分子量乘積的總和，計算公式如下：

式中，Mi：單鏈分子量

         mi：具有相應分子量的鏈質(zhì)量

         wi：具有某一種分子量的質(zhì)量占總質(zhì)量的比例

根據(jù)重均分子量和數(shù)均分子量的定義，我們可以發(fā)現(xiàn)，重均分子量Mw更強調(diào)分子量最高的部分對平均分子量做出的貢獻，數(shù)均分子量Mn強調(diào)某一范圍中分子數(shù)量最多的那部分對平均分子量做出的貢獻。

03

多分散系數(shù)D

除了少數(shù)天然高分子如蛋白質(zhì)、 DNA 等外，高分子化合物的分子量是不均一的，實際上是一系列同系物的混合物， 這種性質(zhì)稱為“多分散性” 。多分散性可以用多分散性系數(shù)D 來定量地表征， D=Mw/Mn，當分子量完全均一時D=1，分子量分布越寬，D值越大。

從重均分子量Mw、數(shù)均分子量Mn及多分散系數(shù)D的定義，我們可以看出，合成微球時，Mn、Mw及D都需要嚴格控制的。

04

分子量的測定

分子量的測定用分子排阻色譜法。分子排阻色譜法是根據(jù)待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。大分子最早被流動相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時間tR較短；小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時間較長，表現(xiàn)為保留時間tR較長；其余分子則按分子大小依次被洗脫。因此保留時間tR與重均分子量Mw大小呈函數(shù)關系，方程如下：

 lgMw=a+btR（a、b均為常數(shù)）以凝膠色譜柱，采用排阻色譜法，可以得到高分子的色譜圖，是一個色譜峰，實際是不同分子量正態(tài)分布圖，如圖2。

圖2 高分子的流出色譜圖

05

分子量分布

分子量分布是指根據(jù)分子量篩分或其他分離方法，把分子量分開，把復合物分解成不同分子量的組分的一種技術?？偟膩碚f，分子量分布是一種研究一種具有某種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中，分子量相互不同的組分的相對比例的一種技術。

圖3 分子量分布曲線

圖3中，橫坐標為分子量，從小到大排列?？v坐標分為左右兩邊，左邊代表信號每種分子量的信號強度，越高代表這個分子量的分子越多。右邊代表累積分的結(jié)果，即圖中那條從0%開始慢慢漲到100%的曲線，這條稱為累積積分曲線，利用它可以直接在圖中估計任意分子量區(qū)間的分子在總分子中的占比。

06

分子量計算與GPC統(tǒng)計軟件

再通過一系列分子量標準物質(zhì)和適宜的 GPC 軟件（目前多數(shù)高效液相色譜品牌都有GPC軟件插件供選擇），可以計算出重均分子量Mw、數(shù)均分子量Mn、分子量分布和多分散系數(shù)D。從而對多糖做質(zhì)量控制。

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武漢匯研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子層析介質(zhì)研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的高新技術企業(yè)。公司擁有大批高科技人才，在研發(fā)和創(chuàng)新能力方面投入了大量資金，擁有多項專利技術。