Q1離子交換條件怎樣設(shè)定?
陽離子:pH值低于等電點0.5左右,掛柱模式;pH值高于等電點0.5左右,流穿模式。陰離子:pH值高于等電點0.5左右,掛柱模式;pH值低于等電點0.5左右,流穿模式。
Q2蛋白純化過程中離子填料如何選擇?
根據(jù)蛋白的等電點,如果蛋白等電點在8左右,采取陽離子掛柱陰離子流穿模式。如果蛋白等電點在6左右,就反過來,采用陰離子掛柱陽離子流穿。掛柱的可以考慮用復合填料MMC或MMA代替。一般都需要用兩根柱子,一陰一陽,一個掛柱模式一個流穿模式。
Q3分子篩分離效果不太好是什么原因?
a.目標蛋白和雜質(zhì)的分子量差異比較小
b.裝柱高度在60cm,純化組分分離一般上樣量控制在5%以內(nèi),組群分離控制在30%。
Q4重力柱如何使用?
重力柱跟正常的層析相比,原理完全一樣,只是沒有檢測器的配合,所有的收集樣品全憑經(jīng)驗。原則上,凝膠過濾三分之一柱體積收集樣品,收集2-3倍上樣量。其余掛柱的,換洗脫液后1個柱體積開始收集,收2-3個柱體積。
Q5親和鎳純化原核胞外蛋白選擇高分辨率,重力柱可以裝這款填料嗎?
重力柱一般選擇Ni-IMAC-FF,平均粒徑90μm,HP的平均粒徑是37μm,小粒徑分辨率高,同時反壓也比較大,一般重力柱選擇90μm的。
Q6Q柱和Ni柱在使用中出現(xiàn)了填料發(fā)紅的情況,可以洗掉嗎?
填料本身是沒有紅色的物質(zhì),確認一下樣品中是否有紅色的雜質(zhì)吸附在微球上,如酚紅或色素等。如果是吸附的雜質(zhì),可以嘗試用高鹽清洗一下。如果還不行,可以嘗試用8M尿素或者1M氫氧化鈉+30%異丙醇清洗。
Q7怎樣去除樣品中的色素?
a.30PG脫鹽柱處理;
b.Q柱,結(jié)合模式;
c.SP柱,流穿模式。
Q8什么是嗜硫吸附?Plasmid對閉環(huán)DNA是嗜硫吸附嗎?為什么該填料對開環(huán)DNA不吸附?
很多個堿基組成DNA鏈,鏈與鏈之間通過二硫鍵結(jié)合。我們這個Plasmid填料就是作用在二硫鍵上的。開環(huán)DNA的二硫鍵被打開了,所以填料Plasmid不能吸附開環(huán)DNA。
Q9Ni柱是每次用完后都要清洗再生嗎?(上樣后,淋洗的時候,5ml/min的流速,柱壓在0.22)
最好是每次洗脫結(jié)束后都重新再生一次,如果樣品比較干凈,3-5次后,再掛鎳重生也可以。如果不再生,洗脫后用純水洗,然后再過平衡液,再用20%乙醇保存。如果到了生產(chǎn)級別,建議每使用一次,都清洗,可以增加填料的壽命。
Q10Ni-IDA或者是Ni-IMAC,使用過程中發(fā)現(xiàn)填料變成棕褐色是什么原因?
是因為填料上的Ni脫落,并在堿性環(huán)境中發(fā)生化學反應(yīng)生成氫氧化鎳沉淀所致。一般可以用0.1M的EDTA緩慢沖洗兩小時以求復原。
Q11預活化介質(zhì)偶聯(lián)配基時,偶聯(lián)時間如何確定?
偶聯(lián)時間要根據(jù)實際反應(yīng)情況跟蹤控制。一般以上清液中,待偶聯(lián)物質(zhì)濃度不再減小作為偶聯(lián)完成的根據(jù)。拿蛋白來說,即為上清液UV280值不再有明顯的降低,即可認為偶聯(lián)過程已經(jīng)完成。
Q12填料該如何保存?
親和填料,一般2-8°C保存,其余填料,室溫陰暗保存。不能凍結(jié),一旦結(jié)冰凍結(jié),復融時填料基質(zhì)有可能會破碎。
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