填料的選擇與應(yīng)用相關(guān)問題解答

Q1離子交換條件怎樣設(shè)定？

      陽離子：pH值低于等電點0.5左右，掛柱模式；pH值高于等電點0.5左右，流穿模式。陰離子：pH值高于等電點0.5左右，掛柱模式；pH值低于等電點0.5左右，流穿模式。

Q2蛋白純化過程中離子填料如何選擇？

      根據(jù)蛋白的等電點，如果蛋白等電點在8左右，采取陽離子掛柱陰離子流穿模式。如果蛋白等電點在6左右，就反過來，采用陰離子掛柱陽離子流穿。掛柱的可以考慮用復合填料MMC或MMA代替。一般都需要用兩根柱子，一陰一陽，一個掛柱模式一個流穿模式。

Q3分子篩分離效果不太好是什么原因？

a.目標蛋白和雜質(zhì)的分子量差異比較小

b.裝柱高度在60cm，純化組分分離一般上樣量控制在5%以內(nèi)，組群分離控制在30%。

Q4重力柱如何使用？

      重力柱跟正常的層析相比，原理完全一樣，只是沒有檢測器的配合，所有的收集樣品全憑經(jīng)驗。原則上，凝膠過濾三分之一柱體積收集樣品，收集2-3倍上樣量。其余掛柱的，換洗脫液后1個柱體積開始收集，收2-3個柱體積。

Q5親和鎳純化原核胞外蛋白選擇高分辨率，重力柱可以裝這款填料嗎？

      重力柱一般選擇Ni-IMAC-FF，平均粒徑90μm，ＨＰ的平均粒徑是37μm，小粒徑分辨率高，同時反壓也比較大，一般重力柱選擇90μm的。

Q6Q柱和Ni柱在使用中出現(xiàn)了填料發(fā)紅的情況，可以洗掉嗎？

      填料本身是沒有紅色的物質(zhì)，確認一下樣品中是否有紅色的雜質(zhì)吸附在微球上，如酚紅或色素等。如果是吸附的雜質(zhì)，可以嘗試用高鹽清洗一下。如果還不行，可以嘗試用8M尿素或者1M氫氧化鈉+30%異丙醇清洗。

Q7怎樣去除樣品中的色素？

a.30PG脫鹽柱處理；

b.Q柱，結(jié)合模式；

c.SP柱，流穿模式。

Q8什么是嗜硫吸附？Plasmid對閉環(huán)DNA是嗜硫吸附嗎?為什么該填料對開環(huán)DNA不吸附？

      很多個堿基組成DNA鏈，鏈與鏈之間通過二硫鍵結(jié)合。我們這個Plasmid填料就是作用在二硫鍵上的。開環(huán)DNA的二硫鍵被打開了，所以填料Plasmid不能吸附開環(huán)DNA。

Q9Ni柱是每次用完后都要清洗再生嗎？（上樣后，淋洗的時候，5ml/min的流速，柱壓在0.22）

      最好是每次洗脫結(jié)束后都重新再生一次，如果樣品比較干凈，3-5次后，再掛鎳重生也可以。如果不再生，洗脫后用純水洗，然后再過平衡液，再用20%乙醇保存。如果到了生產(chǎn)級別，建議每使用一次，都清洗，可以增加填料的壽命。

Q10Ni-IDA或者是Ni-IMAC，使用過程中發(fā)現(xiàn)填料變成棕褐色是什么原因？

      是因為填料上的Ni脫落，并在堿性環(huán)境中發(fā)生化學反應(yīng)生成氫氧化鎳沉淀所致。一般可以用0.1M的EDTA緩慢沖洗兩小時以求復原。

Q11預活化介質(zhì)偶聯(lián)配基時，偶聯(lián)時間如何確定？

      偶聯(lián)時間要根據(jù)實際反應(yīng)情況跟蹤控制。一般以上清液中，待偶聯(lián)物質(zhì)濃度不再減小作為偶聯(lián)完成的根據(jù)。拿蛋白來說，即為上清液UV280值不再有明顯的降低，即可認為偶聯(lián)過程已經(jīng)完成。

Q12填料該如何保存？

      親和填料，一般2-8°C保存，其余填料，室溫陰暗保存。不能凍結(jié),一旦結(jié)冰凍結(jié)，復融時填料基質(zhì)有可能會破碎。