豬圓環(huán)疫苗純化工藝的初探

摘要：

      國內(nèi)絕大部分動物疫苗都是滅活、減毒或無毒的病原體疫苗（第一代動物疫苗），滅活、減毒或無毒的病原體疫苗因為殘留大量的病原體及其碎片、HCP、DNA片段而導(dǎo)致免疫后動物出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，而且疫苗免疫原性和反應(yīng)原性較低。面對上述動物免疫后出現(xiàn)的不良反應(yīng)，均采用基因改造、更換表達系統(tǒng)、添加蛋白標(biāo)簽來提高產(chǎn)量、純度，從側(cè)面降低副反應(yīng)。而這些方式所達到的效果均不顯著，而且這三種方法會涉及到生產(chǎn)工藝的變更和疫苗免疫原性和反應(yīng)原性不同程度的降低。

豬圓環(huán)疫苗現(xiàn)狀

      豬圓環(huán)病毒疫苗（porcine circovirus，PCV）有兩個血清型PCV-1和PCV-2，其中PCV-1為非致病性的病毒，PCV-2為致病性的病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）的主要病原。

      近年來，隨著動物疫苗在疾病預(yù)防中的地位日益重要，很多企業(yè)把研究力量投入到新的疫苗生產(chǎn)工藝上，對疫苗質(zhì)量要求也日益提高。豬圓環(huán)疫苗評價指標(biāo)中，除抗原含量外，應(yīng)激反應(yīng)是另一重要指標(biāo)。豬圓環(huán)疫苗之所以存在應(yīng)激反應(yīng)，是因為現(xiàn)有生產(chǎn)工藝在獲得PCV2抗原的同時，不可避免地伴生了大量異源的與豬圓環(huán)病毒免疫無關(guān)物質(zhì)(占比99%以上)。通過分離純化的豬圓環(huán)病毒疫苗，不僅可以濃縮提高抗原含量，使抗體效價顯著提升，抗體高峰期提前，還能大幅去除非抗原蛋白，降低應(yīng)激反應(yīng)。

      豬圓環(huán)疫苗的生產(chǎn)方式主要為滅活疫苗和基因工程苗。不同生產(chǎn)方式的疫苗，所需純化的工藝也不同。國內(nèi)豬圓環(huán)疫苗種類、毒株、生產(chǎn)企業(yè)名錄詳見表1。

表1：國內(nèi)豬圓環(huán)疫苗種類、毒株、生產(chǎn)企業(yè)名錄

資料來源：長江證券研究所研究報告

滅活疫苗的純化工藝

      滅活疫苗多采用微載體懸浮培養(yǎng)的方式來獲得高滴度病毒，滅活疫苗的生產(chǎn)方式得到全病毒顆粒，根據(jù)病毒顆粒與雜質(zhì)分子量的差異，采用4FF或6FF等凝膠過濾介質(zhì)進行組分分離，病毒顆粒經(jīng)過層析柱外水體積（層析填料微球之間的孔隙，路徑短）先流出，而蛋白質(zhì)和核酸經(jīng)過層析柱內(nèi)水體積（層析填料微球內(nèi)部的孔徑，路徑長）后流出，從而達到分離目的。該純化工藝的回收率超過70%，缺點是層析填料用量大，上樣量不能超過層析填料體積的30%，純化效率較低。產(chǎn)品參數(shù)詳見表2。

表2：4FF、6FF產(chǎn)品相關(guān)參數(shù)（凝膠過濾系列）

基因工程苗的純化工藝

      PCV-2含有兩個功能性的開放閱讀框（ORF），其中ORF2編碼Cap蛋白是豬圓環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可自我裝配成病毒性粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的抗體反應(yīng)并獲得免疫保護，是設(shè)計豬圓環(huán)疫苗的首選目標(biāo)基因。

1、原核表達的純化工藝

      在原核表達中，應(yīng)用較廣的是通過將PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入大腸桿菌原核載體中，利用大腸桿菌進行PCV-2的Cap蛋白與組氨酸（His標(biāo)簽）融合表達，獲得含His標(biāo)簽的Cap蛋白，制備亞單位疫苗。

      原核表達生產(chǎn)方式得到含有組氨酸（His標(biāo)簽）的蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的組氨酸（His標(biāo)簽）對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，采用Ni-6FF的親和層析介質(zhì)進行分離純化，由于不同的螯合配基與Ni上的6個原子鍵結(jié)合數(shù)量不一樣，故Ni-6FF分為3種類型：IDA為3個原子鍵結(jié)合配基，3個原子鍵結(jié)合蛋白；IMAC為4個原子鍵結(jié)合配基，2個原子鍵結(jié)合蛋白；TED為5個原子鍵結(jié)合配基，1個原子鍵結(jié)合蛋白。該純化工藝的回收率和純度是最高的，缺點是原核表達容易出現(xiàn)包涵體，需要加入尿素或鹽酸胍將包涵體進行溶解后純化，然后將純化得到的蛋白進行復(fù)性來提高疫苗效果，蛋白復(fù)性的難度較大，操作也較為繁瑣。產(chǎn)品參數(shù)詳見表3。

表3：Ni-6FF產(chǎn)品相關(guān)參數(shù)（親和層析系列）

2、真核表達的純化工藝

      在真核表達中，應(yīng)用較廣的是通過將PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入到昆蟲桿狀病毒，用昆蟲細胞培養(yǎng)，獲得重組的PCV-2的Cap蛋白，制備亞單位疫苗，目前昆蟲桿狀病毒表達Cap蛋白制備的基因工程亞單位疫苗已實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，故詳述該純化工藝的商業(yè)化應(yīng)用。

真核表達生產(chǎn)方式得到不含標(biāo)簽的蛋白，根據(jù)蛋白的等電點（pI）在不同pH條件下所帶電荷種類不同，采用Q-HPR或SP-HPR通過配基所帶相反電荷進行異性電荷相吸。蛋白緩沖液中pH＞pI，蛋白帶負電荷，選用Q-HPR強陰離子交換介質(zhì)；蛋白緩沖液中pH＜pI，蛋白帶正電荷，選用SP-HPR強陽離子交換介質(zhì)。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)使用的培養(yǎng)基等原材料成本非常昂貴，為降低純化工藝中的損失，回收率成為純化工藝要求最主要的指標(biāo)。產(chǎn)品參數(shù)詳見表4。

表4：Q-HPR、SP-HPR產(chǎn)品相關(guān)參數(shù)（離子交換系列）

應(yīng)用數(shù)據(jù)

1、純化圖譜

 2、純度檢測

表5：純化前后樣品信息

發(fā)展方向

      傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)工藝中，僅通過離心、過濾和沉淀技術(shù)等手段進行簡易的分離，現(xiàn)將離心、過濾、層析等方法的有力結(jié)合，逐漸成為動物疫苗分離純化的主流，應(yīng)用先進的濃縮和分離純化技術(shù)是提高疫苗效價、降低應(yīng)激反應(yīng)的有效手段，精制疫苗將成為今后發(fā)展的必然趨勢。由于本人僅專注于純化工藝的開發(fā)，文中錯誤還望各位讀者批評指正，互相學(xué)習(xí)，共同進步！